La contaminación difusa derivada de la actividad agrícola es hoy en día uno de los grandes problemas medioambientales en muchos países de Europa. Existe una gran preocupación principalmente respecto a dos aspectos: por un lado, el aumento de la concentración de nitratos en las aguas superficiales y subterráneas y, por otro lado, la contaminación atmosférica que potencia el efecto invernadero, la destrucción de la capa de ozono y la lluvia ácida. Estos problemas medioambientales y sanitarios que producen el aporte de fertilizantes nitrogenados en la agricultura, han originado un compromiso entre la obtención de una elevada productividad y una cosecha de calidad, con un mínimo impacto ambiental. Para obtener una producción agraria “sostenible” es necesario, por un lado, conocer en profundidad los procesos relacionados con las transformaciones del nitrógeno en el suelo así como las distintas formas en las que el N es absorbido por la planta y cómo éstas inciden en su crecimiento y desarrollo y, por otro lado, desarrollar nuevos fertilizantes y nuevas formas de aplicación, asociadas a la utilización de productos capaces de inhibir las actividades de los microorganismos implicados en las transformaciones del nitrógeno presente en el suelo. Por tanto, cuanto mejor conozcamos la fisiología de las plantas de manera integrada, no sólo los caracteres fisiológicos o bioquímicos responsables de la asimilación del N, sino su interacción con el metabolismo de carbono, seremos capaces de avanzar en el diseño de nuevos tipos de fertilizantes, de transformar plantas o mejorarlas por métodos tradicionales de manera que posean los mecanismos metabólicos necesarios para una mayor eficiencia en el uso del nitrógeno, así como mejorar los métodos culturales reduciendo el impacto ambiental del uso de los fertilizantes nitrogenados.
El estrés abiótico es el principal limitante de la producción vegetal, por encima de la limitación por nutrientes o del estrés biótico (patógenos, y pestes). Las selecciones de variedades actuales y la presión que se ejerce sobre la explotación agrícola, hacen que determinados estreses ambientales se muestren como uno de las principales objetivos a solventar. En España la sequía, el frío, las elevadas temperaturas, las deficiencias nutricional asociadas con el suelo, la salinidad de determinados terrenos, la excesiva irradiancia solar en determinadas zonas y otros estreses, o incluso una mezcla de ellos pueden inducir la senescencia vegetal y disminuir no sólo la producción vegetal en gran medida sino también su calidad e introducir incertidumbre sobre las decisiones del agricultor final. Muchos de estos estreses son capaces de alterar el equilibrio entre la producción de radicales libres y especies de oxígeno activas (EOA) y las defensas antioxidantes de la plantas situación que conlleva a un aumento en el daño oxidativo sobre los componentes celulares y a una situación de estrés oxidativo. El primer trabajo en el que se demostraba que un estrés abiótico, como la sequía, podía inducir un estrés oxidativo se realizó con plantas de guisante (Moran et al., 1994).
La tolerancia a la nutrición amoniacal conlleva una alta demanda de esqueletos carbonados para la asimilación del amonio en la raíz dando lugar a la acumulación y translocación de compuestos aminados (aminoácidos, poliaminas, urea). La alta disponibilidad de aminoácidos puede acelerar la liberación de amonio fotorrespiratorio y su emisión a la atmósfera en forma de amoníaco. Los niveles altos de glutamato favorecen la síntesis de ornitina y citrulina, precursores de la arginina. El ciclo de la urea es un punto de conexión entre estos metabolitos. La acción coordinada de la arginasa y de la ureasa podría proporcionar un mecanismo para reciclar el N de la urea o favorecer la volatilización de amoniaco. El conocimiento del balance entre la emisión y consumo de N en suelo y planta es imprescindible a la hora de definir políticas de fertilización sostenible.
Imagen de plantas de guisante (a) y espinaca (b) crecidas con soluciones conteniendo nitrato o amonio. Se observa que, mientras que las plantas de guisante toleran la nutrición amoniacal, las plantas de espinaca crecidas con amonio detenienen su crecimiento e incluso aceleran la formación de botones florales (c)
Los nódulos de leguminosa son un buen modelo para estudiar los sistemas antioxidantes de plantas. Debido a la labilidad los componentes de la nitrogenasa, complejo enzimático que lleva a cabo la fijación biológica del nitrógeno atmosférico, son necesarios sistemas de defensa frente a las EOA. La síntesis de leghemoglobinas y las barreras a la difusión del O2 es un sistema defensivo habitual en los nódulos de leguminosas. Además, otros antioxidantes de leguminosas presentes son las superóxido dismutasas (SODs), los enzimas del ciclo ascorbato-glutatión y antioxidantes de baja masa molecular como el ascorbato o el glutatión y homoglutatión, presentes en elevadas concentraciones en los nódulos (Dalton 1995). Sin duda, la presencia de todos estos antioxidantes señala con rotundidad los problemas del proceso de fijación de nitrogeno con el oxígeno y sus EOA.
Las nuevas técnicas de clonación de DNA y de expresión de recombinante de proteínas pueden permitir sobre-expresar a gran escala proteínas de origen vegetal con función antioxidante en organismos procariotas [Moran et al., (2002; 2003)] o eucariotas [Iturbe-Ormaetxe et al., (1992)]. La sobre-expresión en estos sistemas biológicos heterólogos permite obtener grandes cantidades de proteínas muy poco abundantes en la célula de orígen, lo cual permitirá conocer y caracterizar estas proteínas con función antioxidante. de origen vegetal. Entre ellas hemos participado en la caracterización de las siguientes: la leghemoglobina II de cowpea, que fue la primera hemoglobina recombinante con capacidad para unir O2 de modo reversible (tanto de plantas como de humanos) [Arredondo-Peter et al., (1997)]; La hemoglobina I de arroz, una hemoglobina no simbiótica con la mayor afinidad por oxígeno conocida hasta este momento [Arredondo-Peter et al., (1997b)]; La ferri-leghemoglobina reductasa de nódulos de soja, un enzima que reduce la Lb3+ a su forma fisiológica funcional Lb2+O2 [Moran et al., (2002); Urarte et al (In press)]; y la FeSOD de nódulos de cowpea [Moran et al., (2003)] frente a la que se han obtenido anticuerpos monoespecíficos, y que es la primera FeSOD de eucariotas cuya estructura 3-D ha sido descrita [Muñoz et al., (2003; 2005).
La ferri-leghemoglobina reductasa de nódulos de soja, una flavo enzima que reduce la Lb3+ a su forma fisiológica funcional Lb2+O2 puede ser sobre-expresada en importantes cantidades de manera recombinante.
Los nódulos de leguminosas son además un sistema modelo interesante para el estudio de hemoglobinas y de antioxidantes, y entre estos últimos nos fijaremos en la SOD: La SODs es un enzima antioxidante esencial para la vida oxigénica Sin embargo, es fácilmente inactivable por ataque nitrativo (mediado por el anión peroxinitrito, el cual es un potente oxidante). Este hecho se ha utilizado en una patente reciente para estimar el daño oxidativo producido por peroxinitrito sobre FeSOD recombinante en un bioensayo in vitro (Moran et al. Patente nº 200702035).
Estructura del centro catalítico de la FeSOD de cowpea (izda), comparación frente a la MnSOD humana y a otras FeSOD de bacterias (centro). Detalle de la interaccion entre subunidades en la proximidad del centro catalítico (dcha) (Muñoz et al., 2003; Muñoz et al., 2005)
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