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Grupo de investigación de Fisiología Vegetal y Agrobiología

Líneas de Investigación

Nutrición nitrogenada en plantas. Estrés por amonio y mecanismos de tolerancia

 

El nitrógeno inorgánico es absorbido por las raíces de la planta principalmente en forma de amonio (NH4+) o nitrato (NO3-). A pesar de tener un coeficiente de difusión mayor y desaprovecharse en gran medida debido a la lixiviación, el nitrato es preferido por las plantas en los sistemas agrícolas, ya que está presente a concentraciones mayores. La contaminación difusa derivada del abuso de fertilizantes nitrogenados es hoy en día uno de los grandes problemas medioambientales en muchos países. Existe una gran preocupación principalmente debido a, por un lado, el aumento de la concentración de nitratos en las aguas superficiales y subterráneas (eutrofización) y, por otro lado, la contaminación atmosférica que potencia el efecto invernadero, la destrucción de la capa de ozono y la lluvia ácida (volatilización de amoniaco). Estos problemas medioambientales han originado un compromiso entre la obtención de una elevada productividad y una cosecha de calidad, con un mínimo impacto en los ecosistemas naturales. Para obtener una producción agraria “sostenible” es necesario, por un lado, conocer en profundidad los procesos relacionados con las transformaciones del nitrógeno en el suelo así como las distintas formas en las que el N es absorbido por la planta y cómo éstas inciden en su crecimiento y desarrollo. Por otro lado, es vital desarrollar nuevos fertilizantes y nuevas formas de aplicación, asociado a la utilización de productos capaces de inhibir las actividades de los microorganismos implicados en las transformaciones del nitrógeno presente en el suelo. Por tanto, cuanto mejor conozcamos la fisiología de las plantas de manera integrada, no sólo los caracteres fisiológicos o bioquímicos responsables de la asimilación del N, sino su interacción con el metabolismo de carbono, seremos capaces de avanzar en el diseño de nuevos tipos de fertilizantes, de transformar plantas o mejorarlas por métodos tradicionales de manera que posean los mecanismos metabólicos necesarios para una mayor eficiencia en el uso del nitrógeno.

Las especies agrícolas han sido tradicionalmente cultivadas bajo nutrición nítrica o mixta por lo que la mayoría de las variedades actuales no están adaptadas a una nutrición amoniacal. El amonio (NH4+) resulta tóxico para la mayoría de las plantas cuando éstas son cultivadas exclusivamente en su presencia sin otra fuente de nitrógeno adicional (síndrome amoniacal). La tolerancia a la nutrición amoniacal conlleva una alta demanda de esqueletos carbonados para la asimilación del amonio en la raíz dando lugar a la acumulación y translocación de compuestos aminados (aminoácidos, poliaminas, urea). La alta disponibilidad de aminoácidos puede acelerar la liberación de amonio fotorrespiratorio y su emisión a la atmósfera en forma de amoniaco. El estudio de los mecanismos de tolerancia al NH4+ en plantas, así como la fisiología de las nutriciones nítrica y ureica son imprescindibles a la hora de definir políticas de fertilización sostenible.

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Imagen de plantas de guisante (a) y espinaca (b) crecidas con soluciones conteniendo nitrato o amonio. Se observa que, mientras que las plantas de guisante toleran la nutrición amoniacal, las plantas de espinaca crecidas con amonio detenienen su crecimiento e incluso aceleran la formación de botones florales (c)

Origen oxidativo del NO y otras especies de nitrógeno en plantas

 

El óxido nítrico (NO) es una molécula vital para las plantas ya que participa en numerosas funciones relacionadas con el desarrollo y el crecimiento. La naturaleza dual del NO, por un lado como molécula señalizadora esencial y por otro como responsable de modificaciones post-traduccionales en biomoléculas que conducen en última instancia al daño celular, es aún poco conocida. Se conocen diversas fuentes de producción de NO en plantas, siendo la más estudiada y caracterizada la reducción de NO3- por la nitrato reductasa citosólica (cNR). Sin embargo, todavía existen muchas incógnitas sobre algunas de las reacciones que conllevan a su formación. Las vías oxidativas de formación de NO en plantas han sido poco estudiadas y a diferencia de en animales o en bacterias no ha podido confirmarse la existencia de una enzima tipo óxido nítrico sintasa (NOS). Creemos que es fundamental identificar las vías oxidativas de la producción de NO y otras especies de nitrógeno en condiciones de nutrición amoniacal. Para ello trabajamos en esta línea desde dos perspectivas: primero, una aproximación in vitro para detectar la especie oxidada de nitrógeno peroxinitrito (ONOO-) y segundo, el estudio de la oxidación del amonio en plantas superiores.

Se desarrolló un bioensayo para la detección de ONOO- usando una proteína vegetal recombinante, la Fe-superóxido dismutasa de cowpea (rVuFeSOD), como molécula diana para la nitración de tirosinas. Ésta había sido previamente aislada del citosol de los nódulos (Moran et al., 2003). Se generó ONOO- a partir de un compuesto artificial, el SIN-1. El ONOO- es un radical libre que se forma a partir de NO y radical superóxido, responsable de la modificación e inactivación de proteínas por medio de la adición de un grupo nitro (-NO2) al fenilo de las tirosinas, lo que se denomina nitración. La nitración de las tirosinas está relacionada con numerosas enfermedades en animales; en plantas, a pesar de desconocerse en profundidad sus funciones, se ha descrito que puede estar conectada con la senescencia tisular y algún tipo de estrés. El estudio del ONOO- in vivo es particularmente difícil de llevar a cabo tanto en sistemas animales como vegetales debido a su corta vida media y las bajas concentraciones a las que es producido. Por lo tanto, se precisan nuevas aproximaciones para la detección y modulación de ONOO- en sistemas biológicos. Nuestros estudios han derivado en una patente europea resultante de la extensión de dos patentes nacionales que además de describir la cuantificación de daño oxidativo también incluye la utilización del método para seleccionar compuestos vegetales con función anti-nitrativa (Moran et al., 2009, patente nº WO2009/013384).

 

Western blot SIN 1 nitrotyr dose dep FeSOD_high contrast.jpg

Caracterización de la nitración in vitro de la Fe- superóxido dismutasa recombinante de cowpea (rVuFeSOD). (A) Western-blot anti-nitrotirosina. Calle 1: rVuFeSOD; calle 2: rVuFeSOD nitrada (0.2 mM SIN-1); calle 3: rVuFeSOD nitrada (0.4 mM SIN-1); calle 4: rVuFeSOD nitrada (0.6 mM SIN-1); calle 5: rVuFeSOD nitrada (0.8 mM SIN-1); calle 6: rVuFeSOD nitrada (1 mM SIN-1); calle 7: rVuFeSOD nitrada (1 mM SIN) incubada con desferrioxamina 10 mM; calle 8: rVuFeSOD nitrada (1mM SIN-1) y reducida con ditionito.  Se observa cómo la adición de concentraciones crecientes de SIN-1 en el sistema genera una nitración de la rVuFeSOD dosis-dependiente (B) Réplica del gel teñido con azul de Coomassie. Extraído de Larrainzar et al., 2008.

En otra línea se ha venido trabajando en los mecanismos fisiológicos que dan lugar a la oxidación del NH4+ en plantas. Como ya se ha comentado anteriormente, las plantas pueden crecer utilizando exclusivamente NH4+ como única fuente de nitrógeno, a pesar de provocar cierta toxicidad. Mediante un modelo de crecimiento axénico basado en la nutrición amoniacal se pretende caracterizar la formación de especies oxidadas de nitrógeno como son el NO, el nitrito (NO2-) o el nitrato (NO3-) a partir de NH4+. Asimismo, se está trabajando en el descubrimiento de los mecanismos genéticos y enzimáticos responsables de estas reacciones. 

Utilización biotecnológica y nanotecnológica de los sistemas antioxidantes de plantas

 

Debido a la labilidad los componentes de la nitrogenasa, complejo enzimático que lleva a cabo la fijación biológica del nitrógeno atmosférico, son necesarios sistemas de defensa frente a las ROS que se producen en dicho proceso. Por tanto, los nódulos de leguminosa son un buen modelo para estudiar los sistemas antioxidantes de plantas. La síntesis de leghemoglobinas y las barreras a la difusión del O2 son sistemas defensivos habituales en el nódulo. Otros sistemas antioxidantes de leguminosas son las superóxido dismutasas (SODs), los enzimas del ciclo ascorbato-glutatión (ascorbato peroxidasa, glutatión sintetasa) y antioxidantes de baja masa molecular como el ascorbato o el glutatión y homoglutatión, presentes en elevadas concentraciones en los nódulos. Sin duda, la presencia de todos estas biomoléculas señala con rotundidad los problemas del proceso de fijación de nitrogeno con el oxígeno y sus ROS.

Las nuevas técnicas de clonación de DNA y de expresión de proteínas recombinantes pueden permitir sobre-expresar a gran escala proteínas de origen vegetal con función antioxidante en organismos procariotas o eucariotas. La sobre-expresión en estos sistemas biológicos heterólogos permite obtener grandes cantidades de proteínas muy poco abundantes en la célula de origen, lo cual permitirá conocer y caracterizar estas proteínas de origen vegetal con función antioxidante. Hasta la fecha, el grupo ha participado en la caracterización de las siguientes: la leghemoglobina II de cowpea, que fue la primera hemoglobina recombinante tanto de plantas como de humanos con capacidad para unir O2 de modo reversible, (Arredondo-Peter et al., 1997); la hemoglobina I de arroz, una hemoglobina no simbiótica con la mayor afinidad por oxígeno conocida hasta este momento (Arredondo-Peter et al., 1997b); la ferri-leghemoglobina reductasa de nódulos de soja, un enzima que reduce la Lb3+ a su forma fisiológica funcional Lb2+O2 (Urarte et al. 2008); y la FeSOD de nódulos de cowpea frente a la que se han obtenido anticuerpos monoespecíficos, y que es la primera FeSOD de eucariotas cuya estructura 3D ha sido descrita (Moran et al., 2003).

 

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La ferri-leghemoglobina reductasa de nódulos de soja, una flavo enzima que reduce la Lb3+ a su forma fisiológica funcional Lb2+O2 puede ser sobre-expresada en importantes cantidades de manera recombinante. Extraido de Urarte et al., 2008

Efecto de las condiciones ambientales asociadas al cambio climático en la fisiología y el rendimiento de las plantas

 

Respuesta de las plantas fijadoras y no fijadoras de N2 atmosférico a las futuras condiciones ambientales (CO2, efecto de la sequía, aumento de temperatura) descritas por el Panel Intergubernamental del Cambio Climático (IPCC, 2007). Estos trabajos se llevan a cabo en condiciones controladas (cámaras de crecimiento e invernaderos) y en condiciones semi-controladas (túneles de gradiente térmico). En estos trabajos hemos estudiado del efecto del Cambio Climático sobre el rendimiento y los caracteres fisiológicos responsables de la adaptación de las plantas a la falta de agua, temperatura elevada en interacción con el CO2 elevado (Aranjuelo et al. 2005; 2007, 2008; 2009, 2010; 2011). Los resultados obtenidos hasta este momento indica que el efecto del CO2 elevado sobre las plantas, independientemente de si se trata de plantas de crecimiento lento (Aranjuelo et al., 2009; 2011); o rápido (Aranjuelo et al., 2005; 2011 ab; Sanz-Saez et al., 2011), se verá condicionada por su interacción con otros factores ambientales (temperatura, disponibilidad hídrica y nutricional del suelo etc.). A pesar de la diversidad de especies analizadas, en gran parte de ellas he observado que el efecto ambiental sobre la gestión y los balances de C y de N son los principales condicionantes del efecto estimulador del CO2 sobre el crecimiento de las plantas.

 

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Foto de los invernaderos de gradiente térmico.

Los isótopos de C y N aplicados a la fluxómica vegetal.

 

La fluxómica es una disciplina que tiene como objetivo analizar los flujos que ocurren a nivel celular y de órganos. El marcaje de los órganos vegetales con trazadores como 15N y 13C, así como la distribución del marcaje en los distintos compuestos de los diferentes órganos de la planta ofrece una información de gran importancia en los estudios sobre los flujos de carbono y nitrógeno en las plantas. Después de la aplicación de isótopos estables a cultivos celulares o a órganos (pulso), los isótopos se distribuyen a través de la red de actividades metabólicas celulares o de órganos de (Aranjuelo et al., 2009ab; 2011ab; Molero et al., 2011). El doble marcaje de carbono y nitrógeno permite la caracterización de los compuestos que son asimilados y trasladados a los diferentes tejidos. Este punto es de especial relevancia en estudios relacionados con el aumento de CO2, en los que la actividad fotosintética y, en consecuencia la producción de las plantas está condicionada por la relación fuente/sumidero del C y del N en los diferentes tejidos.

 

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Cluster jerárquico representativo del enriquecimiento en 15N de aminoácidos de diferentes órganos vegetales.

 

 

Caracterización proteómica bidimensional

“Proteoma" se refiere al conjunto de proteínas codificadas por el genoma de un organismo; con lo que "proteómica" puede ser entendida como el estudio global de las proteínas por el proteoma, incluyendo los cambios en estructura y la abundancia en respuesta a las condiciones ambientales y de desarrollo. La proteómica se ha revelado como aspecto importante en la evaluación de la capacidad de respuesta de las plantas (Aranjuelo et al., 2011ab). Estos trabajos destacan el hecho de que la evaluación directa de la expresión de la proteína a través de los análisis de proteómica y la aplicación de enfoques metodológicos integrados son muy ventajosos para la identificación de las proteínas implicadas en la capacidad de respuesta de las plantas crecidas en diferentes condiciones ambientales. Esta información puede ser de gran relevancia para comprender la capacidad de respuesta de las plantas a los niveles de CO2 esperables en las próximas décadas, lo que puede ayudar en los futuros programas de mejora.

 

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Gel bi-dimensional de una hoja apical de alfalfa (Medicago sativa L.)

 
 
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