Uno de los principales inconvenientes de la producción de proteínas recombinantes en plantas transgénicas por transformación nuclear es el bajo nivel de expresión (generalmente inferior al 1% de la proteína soluble total) lo que hace difícil la aplicación a gran escala y su explotación empresarial.
La principal ventaja de la transformación plastidial es que en cada plastidio hay 5 000-10 000 copias del genoma con lo que la expresión del transgén es muy eficiente. Se han llegado a alcanzar niveles de la proteína recombinante del 70% respecto a la proteína soluble total. Otras ventajas adicionales son: la incorporación del transgén se produce por recombinación homóloga en una zona precisa y conocida evitándose el efecto de posición; no se produce el fenómeno del silenciamiento génico; se evita la posible dispersión del transgén vía polen ya que los granos de polen de la mayoría de especies cultivadas carecen de plastidios; existen varios sistemas de eliminación del gen marcador de selección con posterioridad a la transformación.
Nuestro laboratorio lleva varios años investigando la producción de diferentes proteínas recombinantes en plantas de tabaco mediante transformación cloroplástica.
Los promotores utilizados son, entre otros: el promotor del psbA (incluida la 5’UTR del gen) y el promotor Prrn fusionado al RBS del gen G10L del bacteriófago T7. Así mismo, se está trabajando en transferir la tecnología disponible a variedades de tabaco comerciales con altos rendimientos de biomasa para maximizar la producción de la proteína recombinante.
La albúmina humana (HSA) es una de las proteínas más utilizadas en medicina. Se emplea a altas dosis en pacientes cirróticos, con shock, trauma y quemaduras entre otras terapias, siendo el coste de este tratamiento muy elevado. Las necesidades a escala mundial de HSA se calculan en torno a las 500 toneladas por año, siendo la proteína intravenosa más utilizada en todo el mundo. La obtención de HSA se ha estudiado en sistemas de expresión microbianos, sin embargo, a diferencia de lo que ocurre con proteínas humanas de menor tamaño, resulta difícil la obtención de altos niveles de HSA en este tipo de sistemas. Utilizando el cultivo de plantas transgénicas como fuente de producción de proteínas recombinantes hemos obtenido HSA en tubérculos de patata vía transformación nuclear, con unos niveles de producción de un 0,2% de la proteína soluble total. Sin embargo, mediante transformación plastidial hemos conseguido producir HSA en cloroplastos de tabaco, con unos niveles medios de producción del 5% de la proteína total. En este caso, la albúmina se agrega formando cuerpos de inclusión. Mediante la coexpresión simultánea de albúmina y tiorredoxina se ha conseguido que no se formen cuerpos de inclusión y que la proteína recombinante se presente mayoritariamente en forma soluble en el estroma del cloroplasto.
Los interferones (IFN) son una familia de proteínas conocidas principalmente por su actividad antiviral. También son potentes inmunomoduladores y poseen propiedades antiproliferativas. De ahí que el IFNa se emplee como terapia estándar para leucemia, carcinomas metastásicos, sarcoma de Karposi y hepatitis B ó C. A pesar de que normalmente se utiliza el IFNa2, el IFNa5 parece ser la forma mayoritaria en hígado y tiene tanta actividad antiviral en células hepáticas tumorales como el IFNa2. El interferón que se emplea actualmente proviene de bacterias, pero este sistema es incapaz de proporcionar suficiente IFNa para suplir las necesidades mundiales a un precio razonable. En la actualidad, estamos trabajando en la obtención de IFNa2 e IFNa5 a partir de cloroplastos de tabaco, disponiendo de líneas con unos niveles de expresión de IFNa2 del 4-8% de la proteína soluble total.
El factor insulínico (IGF-I) es una potente hormona anabólica producida mayoritariamente en el hígado bajo la estimulación de la hormona del crecimiento. Pacientes con cirrosis hepática, atrofia muscular, osteopenia e hipogonadismo sufren malnutrición que puede deberse a la disminución de los niveles de IGF-I circulante. En todos estos casos se recomienda el tratamiento con IGF-I, que además se usa en el tratamiento de otras muchas enfermedades. El enorme potencial de IGF-I ha llevado a numerosos investigadores a intentar su expresión en varios microorganismos. Los mejores resultados se han obtenido en bacteria, donde se produce actualmente, a pesar de que la mayor parte de la proteína no se pliega correctamente, encareciéndose en consecuencia su producción y haciendo el coste del tratamiento muy elevado. Nosotros estamos trabajando en la obtención de plantas de tabaco que expresen altos niveles de IGF-I en sus cloroplastos.
La cardiotrofina-1 (CTF1) es una proteína de la familia de la interleukina-6 relacionada estructural y biológicamente con las citokinas, que se expresa en tejidos de corazón, riñón, músculo e hígado. Se identificó por primera vez, en 1995, por su capacidad de inducir hipertrofia en miocitos cardíacos y su capacidad de ayudar a la supervivencia y proliferación de cardiomiocitos inmaduros. Desde entonces se han descrito muchas otras funciones de la CTF1. Se trata así de una sustancia relativamente nueva pero altamente prometedora para el tratamiento de una diversidad de enfermedades, entre las que cabría destacar hepatitis severas o daño hepático por tóxicos. También serviría para mejorar las condiciones del hígado transplantado y para proteger al hígado remanente tras hepatocarcinomas. El producto disponible en el mercado se obtiene a partir de E. coli. Recientemente, en nuestro laboratorio también se ha abordado la expresión de CTF1 humana en cloroplastos de tabaco.
Desde principios de los años 1990 se han producido diferentes antígenos vacunales en plantas transgénicas y se ha comprobado que son capaces de desarrollar una respuesta inmune frente a importantes patógenos humanos o animales. Algunas de ellas están en fase clínica de estudio y, en concreto, la vacuna frente al virus Norwalk está pendiente de aprobación para uso comercial en EEUU. La producción de vacunas en plantas tiene las siguientes ventajas frente a los sistemas tradicionales de administración de virus muertos o atenuados: mayor seguridad biológica ya que las plantas no se contaminan con patógenos humanos o animales; la planta puede administrase de forma sencilla por vía oral en forma de unidosis encapsulada, evitando el empleo de agujas y jeringuillas; no se requiere el mantenimiento de una cadena de frío para la conservación de la vacuna; sistema económico de producción y fácilmente escalable con las técnicas agrícolas convencionales; posibilidad de producir vacunas multicomponentes.
En nuestro grupo estamos trabajando con el parvovirus canino que produce gastroenteritis hemorrágica en cachorros y animales jóvenes. El epítopo 2L21 corresponde a la región N-terminal de la proteína VP2 de la cápside del virus y confiere inmunidad cuando el péptido sintético se administra por vía parenteral. Hemos expresado en plantas de tabaco el epítopo 2L21 fusionado con la GFP (proteína de fluorescencia verde) o con la CTB (subunidad B de la toxina del cólera). Hemos obtenido niveles de expresión de la proteína quimera de hasta el 31 % de la proteína soluble total, lo que equivale a 7,5 mg/g peso fresco.
Una planta madura en el momento de floración puede producir alrededor de 300 mg de proteína recombinante. La inmunización intraperitoneal de ratones con extractos crudos de proteína soluble total desarrolló una respuesta humoral en el caso de la proteína quimera CTB-2L21 demostrando que esta proteína es inmunogénica pero no así la proteína GFP-2L21. Esto pone de manifiesto el papel potenciador de la respuesta inmune de la proteína CTB, transportando el epítopo a la zona donde debe desencadenarse la respuesta inmune. Mediante ensayos in vitro con una línea celular sensible al parvovirus se ha comprobado que los anticuerpos producidos en plantas son neutralizantes del virus.
También estamos trabajando en la producción de una vacuna frente al papilomavirus humano, responsable directo del cáncer de cuello de útero. Hemos elegido como antígeno la proteína L1 de la cápside del virus por tres motivos: comprobar que se pueden formar partículas pseudovirales (VLPs) en cloroplastos; estas VLPs podrían utilizarse como vacuna frente al cáncer de útero, causado por el virus; estudiar la capacidad de direccionamiento e interacción de la proteína L1 con las células presentadoras de antígeno (utilizando un epítope modelo de la ovalbúmina), lo que activaría la respuesta inmune celular. Se han obtenido altos niveles de expresión de la proteína recombinante (24% de la proteína soluble total). Mediante microscopía electrónica y separación en gradientes de ClCs y sacarosa se ha comprobado la correcta formación de VLPs en el estroma del cloroplasto. La inmunización intraperitoneal de ratones con extractos de plantas desencadenó una respuesta inmune específica con altos títulos de anticuerpos que además eran neutralizantes.
En nuestro laboratorio hemos clonado las tiorredoxinas plastidiales f y m de tabaco. Las plantas con sobreexpresión de la tiorredoxina f presentaron una alteración en la acumulación de carbohidratos. Se observaron niveles hasta 10 mayores de almidón y 5 veces superiores de sacarosa en hoja. Estos resultados se han obtenido con una variedad no comercial, Petite Havana, con baja producción de biomasa. Actualmente se está transfiriendo este carácter a variedades comerciales. Los cálculos estimados de producción de almidón de estas variedades mejoradas serían equivalentes a los de cultivos como cebada o trigo. Dado que los cereales se utilizan actualmente como materia prima para la producción de bioetanol, el tabaco mejorado genéticamente podría ser una fuente alternativa de biomasa en aquellas zonas tradicionalmente productoras de tabaco (Extremadura, Andalucía). De esta forma se evitaría utilizar cultivos de uso alimentario para la producción de biocombustibles y se daría una salida a las zonas tabaqueras de nuestro país que ven peligrar su futuro con la desaparición de las ayudas europeas a este cultivo.
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